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I.INACTIVATION ET STABILISATION DES ENZYMES
II.PRODUCTION ET PURIFICATION D'ENZYMES
1. Inactivation et stabilisation des enzymes.
Perte
du pouvoir catalytique (pendant
l’utilisation / à cause du traitement) quels en sont les mécanismes ?
·
Agrégation :
parfois formation de ponts disulfures intermoléculaires
·
Altération
de la structure primaire
a)
hydrolyse
de la liaison peptidique par H+ ou OH-, protéolyse, autolyse.
b)
Phosphorylation
protéique (protéines kinases)
·
Dissociation
du CoE du site actif : cas des transaminases
·
Dissociation
des protéines oligomèriques en sous-unités.
·
Changement
de conformation irréversible.
·
Inactivation
par cisaillement dans les flux. (cas des réacteurs)
1)
Chaleur
Etalage de la molécule, faible chance de repliement
correct, changements covalents qui se produisent : Enzyme inactivé de
façon irréversible.
2)
Froid
Maximum de stabilité : 0-4°C
Congélation/ décongélation : inactivation de
l’enzyme par déshydratation.
3)
PH
Dépliement dû à des répulsions entre mêmes charges
et des changements covalents, fortement influencés par la force ionique
PH acide ; à pH<4 les groupements histidyls
deviennent sensibles et à forte température il se produit une hydrolyse de la
liaison peptidique / désamination
PH alcalin : les groupements thiols et les
ponts disulfures sont plus réactifs et à haute température il y a échange de
disulfures.
4)
Forces mécaniques
Ultrasons, agitation (forces de cisaillement),
pression (>1000 bars)
b)
Agents chimiques dénaturants
1)
Composés organiques : formateurs de
liaisons H
Urée, formol, chlorure de guanidine ( : très dénaturant)
Interfèrent (intra ou interchaînes) avec des structures qui stabilisent par liaisons hydrogènes, l’état natif de l’enzyme.
2)
Agents oxydants
Oxydation des chaînes latérales de certains Acides
aminés : cystéine (-SH), tryptophane (indole), méthionine…
3)
Sels
# faible concentration : plutôt bénéfiques sauf
les métaux lourds ; Mercure, cadmium, plomb qui peuvent se lier à l’enzyme
et gêner son activité s’ils entrent en compétition avec d’autres ions qui
jouent un rôle activateur.
# forte concentration : plutôt néfastes sauf
(NH4)2SO4 et le phosphate de potassium qui sont souvent utilisés pour
précipiter les protéines, ont tendance à stabiliser l’état natif (ex :
ribonucléase).
4)
Solvants organiques
Alcools primaires : baisse la stabilité
Ethylène glycol : variable selon l’enzyme
considéré
Polyols : tendance à augmenter la stabilité de
la forme native mais également variable selon Enzyme.
5)
Agents tensio-actifs
Agissent à très faible concentration
Tensio-actifs ioniques sont + dénaturants que les
non-ioniques car ils donnent des liaisons électrostatiques en plus des liaisons
hydrophobes.
6)
Agents chélatants
EDTA permet d’inactiver les métallo-enzymes ou
encore des enzymes activés par des métaux.
a)
Recherche d’enzymes
naturellement stables.
Nombreuses sources possibles pour un même enzyme
Enzymes d’organismes thermophiles :
inactivation plus faible au cours du processus de purification et de
conservation ; mais activité catalytique parfois plus faible.
Ex : production de sirop sucrant avec xylose
isomérase thermophile.
b) Additifs.
But : éliminer le facteur inactivant en réduisant
au maximum le processus de déploiement de la protéine.
1)
Stabilisation de la forme
native
# par interaction non covalente spécifique
S,P,I cofacteurs, effecteurs allostériques, ligands
de faible poids moléculaire, ions métalliques (à faible concentration),
protéines, polymères (lipides).
# par agents non spécifiques (chgts
propriétés du solvant)
Espèces
ioniques (fortes concentrations)
Solvants
organiques
Polymères
…contribuent
à l’hydratation préférentielle des protéines ou à l’exclusion préférentielle du
stabilisateur à la surface de la protéine qui force cette dernière à prendre la
conformation avec le minimum d'énergie de surface.
2)
Suppression d’inactivation secondaire
|
Composés |
Effets protecteurs contre… |
|
Glutathion,
cystéine (-SH) |
Radiations
et péroxydes |
|
Vit.
E, acide ascorbique |
Oxydations |
3)
Sels
#faible concentration (=<0.1M)
Ca2+ souvent le plus utilisé, il réduit la
flexibilité de l’enzyme, due à de nombreux points de réticulation, en
neutralisant des charges négatives.
Suivant le même principe on utilise également :
Zn2+
(phosphatase alcaline E. coli)
Mn2+
(lysozyme)
Mg2+
(PK)
#forte concentration(=>0.1M)
(NH4)2SO4 pour purifier de nombreux enzymes.
4)
Action sur le solvant
5)
Action de polymères
Modification ou remplacement de quelques Acides
Aminés.
Domaine prometteur mais techniquement encore peu
développé.
1)
Rigidification de l’état
natif :
la conformation et l’activité catalytique restent inchangés.
2)
Augmentation des
interactions hydrophobes internes.
3)
Réduction de nombreux acides
aminés sensibles aux oxydations.
2. Production et
purification d’enzymes
1)
Sources
Animaux => production limitée en terme de quantité, mais grande
diversité (enzymes plus spécialisées)
Végétaux
=>
quantité qui dépend de la saison (exemple de la péroxydase de raifort)
Micro-organismes
=>
aspect pratique de la mise en culture.
1) Sélection d’une souche ou d’un mico-organisme transformé<o:p>
# forte production dans un temps minimum de fermentation (laps de temps où seules des dépenses sont engendrées)
#
Enzymes extracellulaires de préférence ; en général plus facile à
purifier, en pratique seules les hydrolases (classe 3) sont ainsi produites
(hydrolyse de polymères)
#
Ne pas produire de composés toxiques ou inactivant l’enzyme.
La
plupart des E. proviennent de bacillus (ne donnant plus de spores) ou
d’aspergillus.
Génie
génétique et production de souches transformées, sélection de souches
thermophiles.
1)
Milieux
nutritifs.
·
Composés
synthétiques ou naturels (-chers)
·
Source
de carbone, d’azote, substances minérales.
·
Présence
dans le milieu d’un inducteur de l’enzyme (substrat de l’enzyme : exemple
de l’amidon pour l’amylase, de l’urée pour l’uréase…
# vérification des concentrations
# Induction par un analogue du substrat ou par le
substrat modifié, ou encore par des CoE (cellobiose dans fabrication cellulose)
·
Importance
du choix et de la concentration de la source de carbone (farines, amidon,
mélasses) de d’azote (farines de poisson, caséine, son, composés
organiques : ammonium…) Il y a 2 écoles : la récupération (peu onéreux
mais purifications nécessaires, le milieu n’étant pas défini), l’utilisation de
produits purs achetés dans le marché ;
très chers. Tout dépend de ce que l’on veut faire, des moyens financiers
techniques et humains à notre disposition.
·
Composition
du milieu pour maintenir une souche et produire des spores, souvent différent
de celui utilisé pour inoculer et produire E
·
Risque
d’infection, prévoir un nombre de sub-cultures réduit après la fermentation
principale.
En amont : sélection souche,
optimisation du milieu
Puis
optimisation de la mise en œuvre (10-100L) = « réacteur pilote »
En aval : Production (10-1000
m3)
1)
Fermentation
a)
Cultures
de surfaces
Sur substrats solides
Les moins importantes (sauf pour aspergillus, mucor,
Rhizopus)
a)
Cultures
immergées : liquides
Technique comparable à celles utilisées pour
production d’antibiotiques et de POU (SCP) mais les milieux sont différents.
Paramètres
|
Technique |
Efficacité : taux de purification |
Point isoélectrique |
Focalisation |
2-10 |
|
Taille |
Electrophorèse gel-filtration |
2-10 2-10 |
|
Solubilité |
Précipitation |
2-20 |
|
Thermocoagulation |
Dénaturation thermique |
2-20 |
|
Charge |
Chromato. Echangeuse
d’ions |
2-40 |
|
Fonctions bio. |
Chromato. D’affinité |
50-1000 |
Protéines en suspension dans un milieu liquide. Agglutination de protéines qui deviennent alors insolubles, les protéines agglutinés étant celles qui nous intéressent ou pas.
Technique
rapide et efficace, toujours suivie d’une filtration. Le précipité résulte de
la formation d’un réseau (agrégats) entre protéines dont les propriétés de
solubilités ont été modifiées. On distingue les précipités réversibles,
irréversibles et mixtes.
P.
réversibles : pas de modification de la structure des protéines,
conservation de la fonction, si élimination de l’agent précipitant il y
reformation de la couche d’hydratation et resolubilisation.
P.
irréversibles : Dénaturation des protéines
Au
préalable précipitation des acides nucléiques, parfois présent dans le milieu
après cassage de la cellule.
a)
Précipitation par des sels
Exploitation de l’hydrophobicité +/- grande de la
protéine en modifiant par le sel la couche d’hydratation => Exclusion des
molécules d’eau, modification des tensions de surface et formation du
précipité.
Choix du sel :
·
Teneur
en impuretés réduite
·
Dissolution
faiblement exothermique (augmentation température= risque de dénaturation de
l’enzyme)
·
Grande
différence de densité entre solution de sel et le précipité pour faciliter la
séparation.
(Po4)3- > (SO4)2- > CH3COO-> Cl-
NH4+ >
K+ > Na+ > Li+ > Mg2+
Au pH proche du pHi, les
forces de répulsion électrostatiques sont négligeables, dans un milieu aqueux
polaire, la polarité effective est la + faible, la solubilité est la plus basse
et la précipitation est facilitée.
Ø Utilisation solution
saturante de sel (indications données dans table de solutés), afin de ne pas
trop augmenter le volume de la solution à traiter. 30 min/1 heure, agitation
douce entre 4°C et temp. Labo. (interactions hydrophobes + favorable à la
précipitation mais protéolyse favorisée)
Ø Utilisation de la technique
de précipitation fractionnée ; précipités successifs en augmentant la
concentration en sels pour localiser la fraction contenant la protéine visée.
Ø Récupération précipité par
centrifugation (10000 g 10min) puis
culot dissout dans deux fois son volume par du tampon, puis utilisation directe
ou bien dessalage si on envisage de faire une chromato échangeuse d’ions.
Ø Précipitation au sulfure
d’ammonium pour concentrer, technique utilisée en sortie de colonne de chromato
si concentration en protéine > 1mg/mL
b)
Précipitation par des solvants organiques
Solvants miscibles à l’eau (éthanol, propanol, acétone), alcools primaires. Ils ne doivent pas être trop inflammables, déplacent les molécules d’eau des zones hydratées des protéines, créant de nouvelles interactions électrostatique, d’où formation d’agregats.
Travail de préférence à pHi
Quantité de solvant inversement proportionnelle au
PM
Pour minimiser la dénaturation : travail à
basse température (<0°C si possible)
Ø Conditions
Solvants 20/50% (parfois en fractionné)
Concentration solution protéique 5-30 mg/mL
Force ionique 0.05/0.2M
Centrifugation 5000g pendant 10 min.
Si besoin (en cas de chromato d’affinité) :
élimination du solvant (évaporation sous vide et filtration sur gel. L’avantage
de cette technique est la stérilité due au produits utilisés (utilisation pour
purification des produits sanguins).
c)
Précipitation par polymères non ioniques
·
Pour
diminuer les risques de dénaturation, exemple du polyethylèneglycol, PEG, à
divers degré de polymérisation (PM 2000 ; … ; 10000) utilisé à 5-20%
p/V
·
Précipitation
des protéines plasmatiques
·
Les
protéines sont stériquement exclues des régions du solvant occupé par PEG, ce
qui entraîne localement une surconcentration induisant des interactions
protéines/protéines favorisant la précipitation.
·
Travail
au pHi le plus souvent.
·
Elimination
du PEG du précipité par chromato échangeuse d’ions ou d’affinité ;
utrafiltration.
d)
Précipitation par polyélectrolytes (polymères chargés)
·
Forment
des réseaux intermoléculaires avec les protéines
·
Travail
à pH éloigné du pHi pour avoir protéine bien chargée MAIS gardant son activité.
·
A
faible concentration (bcp chargés) 0.05-0.7% p/V
·
DEAE ;
CM, polyacryliques, alginates…
·
Production
de protéines (à fonction bio) de fusion (recombinante) = protéine d’intérêt sur
laquelle on a ajouté par génie génétique un polypeptide chargé (polyarg. ou
polyasp.) permettant de la récupérer + facilement (bras) mais on doit pouvoir
enlever ce bras facilement, ce dernier ne doit pas baisser l’activité de la
protéine.
·
Dissociation
complexe prot-agent précipitant par variation de pH ou de force ionique, puis
addition d’ions multivalents formant des sels insolubles avec le polymère
chargé.
e)
Précipitation par dénaturation sélective (des protéines contaminantes)
1)
par la température
Thermocoagulation (chaleur), 45-65°C le plus souvent, force ionique, pH, durée fixés par rapport à la protéine que l’on veut garder active, association à des solvants organiques.
Cryoprécipitation (froid), modification solubilité
protéique, congélation/ décongélation lentes : purification des protéines
plasmatiques de haut poids moléculaire.
2)
par variation de pH
modification des liaisons électrostatiques responsables de la structure tertaire de la protéine.
Acide acétique, acide lactique, acide pechlorique ou
TCA (trichlo) (à 10% V/V précipitent les prot. PM>20000) et même des AG à
courtes chaînes
Diethanolamine ou carbonate de Na pH 9-10.5
f)
Précipitation par affinité (jamais immédiatement)
Ø ligand d’affinité sur polymère, macroligand. Le polymère en tombant dans le milieu, s’associe avec l’enzyme (la protéine à purifier de façon plus générale)
Ø purification à un taux élevé
en une seule étape (dissociation ultérieure du complexe par compétition,
variation de pH…)
Précipitation directe : sels/
PEG…, indirecte : polyélecrolytes… de molécules par une suite de
modifications de leur environnement. La précipitation dépend de la
concentration protéique, des autres protéines, du pH, de la température, force
ionique, du pHi. Tout ces paramètres sont à optimiser à chaque fois.
But :
Séparer
des cellules d’un milieu de culture
Clarifier
un extrait brut.
Séparer
certains fragments cellulaires après désintégration
Recueillir
un précipité.
ð
filtration
et centifugation
Séparation de molécules dissoutes (ou de matières en suspension) en fonction du poids moléculaire ou de la taille. Utilisation de membranes à perméabilité sélectives : seules les petites molécules et le solvant traversent (notion de seuil de coupure ou cut-of)
Méthodes
économiques et douces, non dénaturantes.
Filtration
tangentielle : pour gros volumes, les molécules ne font que passer devant
le filtre, entraînées par un courant créé par une pompe.
Filtration
perpendiculaire (la plus courante), molécules qui s’agglutinent, se compactent.
La filtration se fait de plus en plus difficile. Ce type de filtration est
idéal pour de petits volumes.
Ultrafiltration
(UF) PM 500 à 1 million de daltons. (10 à 100micromètres)
Membranes
de composition très variable (polymères), résistantes (lavages après usage),
anisotropiques. (un support, une mb proprement dite : 2 matériaux).
Polarisation
surface.
ð
Membranes
planes
ð
Cartouches
de fibres creuses (baisse du volume de la partie filtrante), fibres resserrées
en faisceau et scellées dans un cylindre. Lavage à contre courant, idéal pour
les gros volumes. Technique utilisée dans certains processus de fermentation,,
les cellules, coincées dans les fibres, voient leurs produits filtrés :
l’étape de purification est donc couplée à celle de la production.
ð
Cartouches
spirales : pour les petits volumes, fluide traversant la membrane qui est
collecté vers un tube central de récupération du filtrat.
Microfiltration
0.1 à 10 microns
Osmose
inverse les sels sont retenus
Nb de tours et nombre de g (le nombre de tours n’apporte pas d’informations si on ne connaît les données spécifique de la centrifugeuse utilisée : pour un rotor donné). En principe rotor identifié par un code suivi d’un chiffre.
ð
Centrifugation
différentielle
Tests d’activité (bilan, rendements), 2 types de rotors : angulaire, swinging (sw) (godets oscillants). A g important, le poids des tubes face à face à une grande importance ; le rotor est réfrigéré (4°C)
Temps
de centrifugation (= temps lorsque la vitesse est atteinte)
Ultracentrifugation,
le vide est fait afin d’éviter les échauffements, les forces de frictions
augmentent la température
Arrêt
avec frein/ sans frein : suivant les choses que l’on veut séparer.
ð
Centrifugations
sur gradient de densité
Saccharose, chlorure de césium, tubes transparents
et minces.
Ce type est utilisé en fin de purification.
1)
… de zone
Le + concentré est situé au fond, selon le mode de
remplissage des tubes, on obtient un gradient linéaire (section des 2
réservoirs égale), quadratiques (S1/S2=2), logarithmique : gradient établi à la température de centrifugation.
Séparation selon le coefficient de sédimentation.
Gradients discontinus (20/15/15%), ce type de
gradient peut être pratique pour séparer deux protéines proches par leur
coefficient de sédimentation.
2)
… isopycnique
centrifugation à l’équilibre. distribution selon
la densité. Le gradient se fait pendant la centrifugation, souvent de
chlorure de césium.
Les macromolécules mélangés occupent alors une
position où leur densité apparente est égale à celle de la solution saline.
a)
Chromatographie
échangeuse d’ions/ adsorption
Selon
la charge.
Utilisation
d’anions / de cations.
Gradient
de force ionique, gradient de pH
Test
UV à la sortie, puis test de l’activité enzymatique.
b)
Chromatographie
sur gel ou tamisage moléculaire.
Selon
la taille et la forme de la molécule ;
Utilisation
de polymères réticulés avec des diamètres de pores bien définis.
Plus
la colonne est haute, plus la qualité de séparation est bonne.(augmentation du
chemin parcouru par la molécule).
c)
Chromatographie
d’affinité
Ligand
fixé sur un support, capable de retenir une protéine donnée (ne retient qu’une
protéine donnée)
ð
Elution :
liquide ne modifiant que légèrement la forme de la molécule (sans la
dénaturer), liquide contenant le ligand non immobilisé, liquide avec le ligand
pour lequel l’enzyme a encore plus d’affinité.
Addition
de stabilisants (sucres, cofacteurs…)
Séchage
sous vide (si volume peu important)
Séchage
par congélation : lyophilisation
Congélation sous le point d’eutexie (fusion), puis
sublimation de la glace sous vide à pression 0.13-13 Pa à température <45°C
Séchage
par pulvérisation
Pulvérisation dans une étuve :
augmentation importante de la surface ; eau évaporée très vite par air
chaud (150°C) pendant un temps très court (pas de dénaturation)
Poudre
sèche ou suspension avec (NH4)2SO4, glygérol, PEG ou précipitation stérile.
Pour
en savoir plus…
Protein
purification : principles, high resolution methods and applications